Методические указания по методам контроля МУК 4.2.4064-24 "Организация и проведение иссле-дований клинических материалов на полиовирусы" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 27 сентября 2024 г.)
Методические указания по методам контроля МУК 4.2.4064-24 "Организация и проведение исследований клинических материалов на полиовирусы"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия че-ловека 27 сентября 2024 г.)
Взамен МУК 4.2.2410-08
Дата введения 27 декабря 2024 г.
1.1. Настоящие методические указания по методам контроля (далее - МУК) описывают по-рядок отбора, упаковки, хранения, транспортирования и проведения лабораторных исследований материалов от больных полиомиелитом и заболеваниями с синдромом острого вялого паралича (да-лее - ОВП), с подозрением на данные заболевания, контактных лиц в очагах полиомиелита и ОВП, здоровых детей из "групп риска" 1 при реализации эпидемиологического надзора за полиомие-литом 2.
──────────────────────────────
1 Примечание: к "группам риска" относятся дети, прибывшие из эндемичных или неблагополучных по полиомиелиту стран (территорий), из семей мигрантов и кочующих групп населения, беженцы, вынужденные переселенцы.
2 Глава XXXII СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекцион-ных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500), с изменениями, внесен-ными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 N 5 (за-регистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный N 67587); от 25.05.2022 N 16 (зарегистрировано Ми-нюстом России 21.06.2022, регистрационный N 68934) (далее - СанПиН 3.3686-21); План действий по поддержанию свободного от полиомиелита статуса Российской Федерации на 2022 - 2024 гг., утвержденный руководителем Федераль-ной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека/Министром здравоохранения Рос-сийской Федерации 02.02.2022 (далее - План действий на 2022 - 2024 гг.); МУ 3.1.1.4016-24 "Эпидемиологический над-зор за полиомиелитом и острыми вялыми параличами", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Рос-сийской Федерации 18.03.2024 (далее - МУ 3.1.1.4016-24).
──────────────────────────────
1.2. Настоящие МУК предназначены для специалистов органов и организаций, осу-ществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор) в отношении полиомиелита, а также могут быть использованы специалистами научно-исследо-вательских, образовательных и медицинских организаций (далее - МО) в целях обеспечения сани-тарно-эпидемиологического благополучия по полиомиелиту.
2.1. Исследования проб клинических материалов от больных полиомиелитом, ОВП и контактных с ними в очагах, выявленных в процессе реализации эпидемиологического надзора за полиомиелитом, позволяет установить этиологию заболевания, выявить источник инфекции и кон-кретных носителей полиовирусов, провести дальнейшее изучение изолятов полиовирусов и группы населения, где были обнаружены полиовирусы [1].
2.2. Выделение полиовирусов из проб фекалий является ключевым фактором для подтвер-ждения или опровержения диагноза "Полиомиелит" у больных с синдромом ОВП.
2.3. Вирусологические исследования проб фекалий от здоровых (без ОВП) детей из "групп риска" 3 позволяют выявить бессимптомных носителей полиовирусов, имеющих эпидемиологиче-скую значимость (дикий полиовирус (далее - ДПВ), полиовирусы вакцинного происхождения (да-лее - ПВВП) любых типов) [3].
2.4. Исследования материалов от больных полиомиелитом, ОВП и контактных с ними в очагах, здоровых детей из "групп риска", проведенные в установленные сроки в соответствии с на-стоящими МУК, позволяют своевременно приступить к организации и проведению санитарно-про-тивоэпидемических (профилактических) мероприятий [1, 2].
3.1. Отбор проб клинических материалов от больных полиомиелитом, ОВП, контактных лиц в очагах полиомиелита и ОВП, здоровых детей из "групп риска" проводят в соответствии с сани-тарно-эпидемиологическими требованиями 4.
3.2. Оптимальный размер фекальной пробы 8 - 10 г. 5. Пробы отбираются в специальные пла-стиковые емкости с завинчивающейся крышкой для забора фекальных проб.
──────────────────────────────
3 Пункт 2522 СанПиН 3.3686-21; главы VII, X МУ 3.1.1.4016-24.
4 Пункты 2446, 2479, 2480, 2522, 2524, 2525 СанПиН 3.3686-21.
5 Руководство по эпидемиологическому надзору за ОВП (англ. WHO. Global guidelines for acute flaccid paralysis (AFP) surveillance in the context of poliovirus eradication, 2023-polioeradication.org (в свободном доступе).
──────────────────────────────
3.3. Если получить фекалии от больного невозможно 6, фекальную пробу можно отобрать из прямой кишки с помощью ректального тампона. Стерильный ватный тампон на деревянной палоч - ке вводят в прямую кишку и протирают слизистую оболочку так, чтобы захватить фекальный мате-риал. Тампон извлекают и, отломив палочку, помещают его в стерильную пробирку или флакон с 1 - 2 мл транспортировочной среды, или 0,9 % раствор NaCl.
3.4. При летальных случаях отбирают секционные пробы (кусочки ткани) из шейного и по-ясничного отделов спинного мозга, продолговатого мозга, Варолиева моста, нисходящего отдела толстой кишки. Пробы отбирают как можно раньше после наступления смерти. Ткани иссекают стерильными инструментами, помещают в отдельные стерильные пластиковые или стеклянные ем-кости с транспортировочной средой или 0,9 % раствором NaCl в количестве, обеспечивающем со-хранение их влажными. Оптимальный объем каждой пробы из шейного и поясничного отделов спинного мозга, продолговатого мозга, Варолиева моста составляет 1 см 3; из толстой кишки иссе-кают сегмент длиной 3-5 см, содержащий фекальные массы 7.
3.5. Отбор проб сывороток крови.
3.5.1. Оптимальный объем сыворотки крови 3-5 мл. Если взятие крови из вены невозможно, проводят забор капиллярной крови объемом 0,3 - 0,4 мл. Для взятия крови используют стерильные емкости без антикоагулянтов и консервантов или специальные вакуумные пробирки с отделением сыворотки без смешивания с форменными элементами, в которых их доставляют в лабораторию.
3.5.2. При использовании стерильных емкостей пробы оставляют при комнатной температу-ре на 2 часа для свертывания крови. После образования сгустка его отделяют от стенки сосуда, про-бу помещают в холодильник при температуре плюс 2 - 8 °C и спустя 24 часа отбирают сыворотку. Сыворотку осветляют центрифугированием при 1500 g в течение 5-10 минут и переносят стериль-ной пипеткой в стерильную емкость.
Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1):
g = (11,7 х 10 -7) x RN 2
(1)
где: g - ускорение свободного падения;
R - радиус (мм) ротора центрифуги (от его оси до конца пробирки); N - скорость в об/мин.
──────────────────────────────
6 ВОЗ. Методические рекомендации "Клиника, диагностика и лечение острого полиомиелита", 1998 - fcgie.ru/page, 4, koord_tsentr.html (в свободном доступе) (далее - Методические рекомендации "Клиника, диагностика и лечение острого полиомиелита", 1998).
7 Методические рекомендации "Клиника, диагностика и лечение острого полиомиелита", 1998.
──────────────────────────────
3.5.3. В случаях, когда отсутствует возможность воспользоваться центрифугой, или обра-ботке подлежит сразу большое количество проб, с помощью стерильной пипетки необходимо осто-рожно отобрать сыворотку от сгустка так, чтобы в нее не попали выпавшие в осадок эритроциты. Во всех случаях необходимо предотвращать попадание в сыворотку эритроцитов, так как при хра-нении они подвергаются гемолизу, что влияет на результаты серологических исследований.
3.5.4. Если отсутствует возможность отделения сыворотки в стерильных условиях, пробы крови в день отбора целесообразно доставлять в учреждение, обеспечивающее деятельность тер-риториального органа, осуществляющего федеральный государственный санитарно-эпидемиологи-ческий контроль (надзор).
3.6. Отбор проб фекалий от здоровых детей из "групп риска" на исследование осуществляет-ся также, как от больных полиомиелитом и ОВП (см. п.п. 3.2 - 3.3).
3.7. МО направляют пробы от больных полиомиелитом, ОВП, контактных лиц в очагах полиомиелита и ОВП, здоровых детей из "групп риска" в учреждения, обеспечивающие деятель-ность территориальных органов, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор).
3.8. Пробы от контактных лиц в очагах полиомиелита и ОВП направляют в ту же лаборато - рию, что и пробы от больного. Пробы от больных полиомиелитом и ОВП, контактных лиц в очагах полиомиелита и ОВП направляются учреждениями, обеспечивающими деятельность территориаль-ных органов, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор), в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями 8, а также мето-дическими документами 9 в Национальную лабораторию по диагностике полиомиелита (далее - НЛДП) или лабораторию регионального центра по эпидемиологическому надзору за полиомие-литом и ОВП (далее - РЦ ПОЛИО/ОВП) (приложение 1 к настоящим МУК).
3.9. Пробы фекалий от здоровых детей из "групп риска", от детей в возрасте до 5 лет из орга-низаций для детей-сирот и детей, оставшихся без попечения родителей, направляют на исследова-ние в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями 10, а также методическими документами 11.
3.10. До отправления любых проб отправитель информирует получателя в соответствии с са-нитарно-эпидемиологическими требованиями 12.
──────────────────────────────
8 Пункты 2447, 2449-2452, 2454 СанПиН 3.3686-21.
9 Пункты 8.4, 8.5, 8.7, 8.8 МУ 3.1.1.4016-24.
10 Пункты 2452-2455 СанПиН 3.3686-21.
11 Пункты 10.5, 10.6 МУ 3.1.1.4016-24.
12 Пункты 2448, 2569 СанПиН 3.3686-21.
──────────────────────────────
3.11. НЛДП, РЦ ПОЛИО/ОВП направляют результаты исследований (положительные или от-рицательные) проб от больных полиомиелитом, ОВП, контактных лиц в очагах полиомиелита и ОВП, здоровых детей из "групп риска" в учреждения, обеспечивающие деятельность территориаль-ных органов, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор), направившие материалы, а также в Координационный центр профилактики полиомиелита и энтеровирусной (неполио) инфекции Роспотребнадзора. Целесообразно направлять результаты в течение 24 часов с момента их получения.
3.12. Учреждениям, обеспечивающим деятельность территориальных органов, осу-ществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор), целесообразно в течение 24 часов с момента получения результатов из НЛДП, РЦ ПОЛИО/ОВП направить их в территориальных орган, осуществляющий федеральный государственный сани-тарно-эпидемиологический контроль (надзор), и в МО, которая организовала отбор проб.
4.1. Транспортирование проб от больных полиомиелитом и ОВП, контактных лиц в очагах полиомиелита и ОВП, от здоровых детей из "групп риска" осуществляется в соответствии с сани-тарно-эпидемиологическими требованиями 13, а также методическими документами 14. Рекоменду-емые сроки доставки проб фекалий от здоровых детей из "групп риска" такие же, как для проб от
больных полиомиелитом и ОВП, контактных лиц в очагах полиомиелита и ОВП 15. О задержке до-ставки и условиях хранения проб организация-отправитель уведомляет получателя (НЛДП или РЦ ПОЛИО/ОВП).
4.2. Все виды проб доставляют с документацией, оформленной в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями 16.
4.2.1. Пробы фекалий от больных полиомиелитом и ОВП доставляются с направлением на лабораторное (вирусологическое) исследование проб фекалий от больного полиомиелитом, ОВП (далее - направление), оформленным в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требовани-ями 17. Сведения в направлении должны совпадать с картой эпидемиологического расследования случая полиомиелита и ОВП 18.
──────────────────────────────
13 Пункты 2486, 2564-2571 СанПиН 3.3686-21.
14 Пункты 8.7, 8.8, 8.9 МУ 3.1.1.4016-24.
15 Пункт 8.7 МУ 3.1.1.4016-24.
16 Пункты 2564, 2568, приложение 26, таблица 17 приложения 7 СанПиН 3.3686-21.
17 Пункт 2447, приложение 26 СанПиН 3.3686-21.
18 Приложение 23 СанПиН 3.3686-21.
──────────────────────────────
Форма направления также используется для транспортирования других видов клинического материала от случаев полиомиелита и ОВП (сыворотки крови, цереброспинальная жидкость, ауто - псийный материал), проб фекалий от контактных лиц в очагах полиомиелита и ОВП, проб фекалий от детей из "групп риска" 19.
4.2.2. При заполнении направления на пробы фекалий от детей из "групп риска" в нем не указывается эпидемиологический номер, но вносится следующая информация:
- отношение обследуемого лица к "группе риска" (указывается территория, откуда прибыл, дата прибытия или кочующая группа населения);
- данные о полученных профилактических прививках против полиомиелита (число получен-ных прививок, дата проведения последней прививки, наименование иммунобиологического лекар-ственного препарата и его серия).
4.3. Для транспортирования изолятов полиовирусов и неполиовирусов (далее - НПЭВ) ис-пользуют пластиковые пробирки с винтовыми крышками с наружной резьбой 20. Транспортирование осуществляют при температуре плюс 2-8 °C. Если отправление изолятов задерживается, до отправ-ки их хранят при температуре не выше минус 20 °C, и доставляют при температуре хранения 21.
4.4. Все виды материалов маркируют этикеткой, на которой указывают идентификационный номер, тип пробы, дату отбора.
4.5. При транспортировании материалов в лабораторию соблюдают принцип тройной упа-ковки 22.
4.5.1. Первичная емкость - маркированный контейнер, пробирка или флакон с завин-чивающейся крышкой, в который помещают пробу. Для дополнительной герметизации используют лабораторную пленку.
4.5.2. Вторичная емкость - прочный водонепроницаемый, не протекающий контейнер (или полиэтиленовый пакет) с адсорбирующим материалом в количестве, достаточном для адсорбции всего образца в случае его протечки. Во вторичную емкость помещают контейнер, пробирку или флакон с пробой. Направление 23, вложенное в полиэтиленовый пакет, закрепляют клейкой лентой снаружи вторичной емкости. Образцы от каждого пациента упаковываются отдельно.
4.5.3. Внешняя упаковка - прочный термоизолирующий контейнер или термос, предназна-ченный для транспортирования биологических материалов. Для обеспечения температурных условий при транспортировании в термоконтейнеры помещают охлаждающие элементы. На внеш-ней поверхности термоизолирующего контейнера, термоса закрепляют этикетку с указанием дан-ных отправителя и получателя (почтового адреса, номера телефона, адреса электронной почты), условий транспортирования.
──────────────────────────────
19 Пункты 8.9, 10.4 МУ 3.1.1.4016-24.
20 Пункт 2552 СанПиН 3.3686-21; ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004 (англ. WHO. Polio Laboratory Manual. 4th ed. 2004 - iris.who.int (в свободном доступе) (далее - ВОЗ. Руководство по лаборатор-ным исследованиям на полиовирусы, 2004).
21 Пункт 2553 СанПиН 3.3686-21.
22 Пункт 524, пункт 8 приложения 8 СанПиН 3.3686-21; ВОЗ. Руководство по правилам перевозки инфекционных ве-ществ, 2021-2022 (англ. WHO. Guidance on regulations for the transport of infectious substances, 2021-2022 - who.int/ publications/i/item/9789240019720 (в свободном доступе).
23 Приложение 26 СанПиН 3.3686-21.
──────────────────────────────
5.1. Сразу после доставки в лабораторию упаковочную коробку, термоконтейнер или термос распаковывают в отведенной для этого зоне, с соблюдением требований биологической безопасно-сти 24. Все работы по подготовке для исследования проб клинических материалов от больных полиомиелитом и ОВП, контактных в очагах полиомиелита и ОВП, здоровых детей из "групп рис-ка" проводятся в боксе микробиологической безопасности 2 класса (далее - БМБ 2 класса) 25.
5.2. В зоне, где происходит распаковка, должны иметься емкость для сбора отходов класса Б, тампоны, смоченные дезинфицирующим раствором, активным в отношении полиовирусов и НПЭВ, БМБ 2 класса 26. Емкости с пробами помещаются на поднос или лоток, покрытый многослойной марлевой салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором. Персонал лаборатории использует маску и резиновые перчатки.
5.3. Внешнюю упаковку и охлаждающие элементы обеззараживают, вторичную емкость обеззараживают и утилизируют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями 27, а также методическими документами 28, первичная емкость хранится вместе с пробами.
──────────────────────────────
24 Глава IV СанПиН 3.3686-21; ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.
25 Пункт 333 СанПиН 3.3686-21; ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.
26 Глава IV СанПиН 3.3686-21; глава X СанПиН 2.1.3684-21 "Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмо-сферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организа-ции и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий", утвержденных постановле-нием Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 3 (зарегистрировано Миню-стом России 29.01.2021, регистрационный N 62297), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государ-ственного санитарного врача Российской Федерации от 26.06.2021 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 07.07.2021, регистрационный N 64146), от 14.12.2021 N 37 (зарегистрировано Минюстом России 30.12.2021, регистра-
ционный N 66692), от 14.02.2022 N 6 (зарегистрировано Минюстом России 17.02.2022, регистрационный N 67331); ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.
27 Пункт 338, таблицы 3, 7 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.
28 МУ-287-113 "Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий меди-цинского назначения", утвержденные Минздравом России 30.12.1998 (далее - МУ-287-113).
──────────────────────────────
5.4. При распаковке материалов в лаборатории проверяют полноту сопроводительных документов, соответствие сведений на этикетке и в направлении, оценивают и фиксируют в рабочих записях состояние поступивших проб ("удовлетворительное" или "неудовлетворительное", наруше-ния упаковки, целостность емкостей с пробами, протечки проб, соблюдение температурного режима). "Удовлетворительными" считают пробы, доставленные в достаточном объеме, с соблюде-нием температурного режима, без нарушения упаковки и протечки проб, без нарушений при запол-нении документации.
5.5. Обо всех выявленных при распаковке материалов нарушениях, случаях несовпадения информации на этикетке и в направлении, неполной информации на этикетке и (или) в направле-нии, нарушениях упаковки, протечках проб сообщают в организацию, направившую материал для исследования.
5.6. Каждой пробе присваивают идентификационный номер, который сопровождает все документы и емкости (центрифужные пробирки, флаконы или пробирки с культурой клеток), отно-сящиеся к данной пробе в процессе ее исследования и хранения в лаборатории, проводящей иссле - дования.
5.7. Приготовление проб к исследованию начинают в течение 48 часов с момента получения проб. В этот период пробы хранят при температуре плюс 2-8 °C. Если исследование проб фекалий будет начато позже 48 часов, пробы хранят при температуре не выше минус 20 °C.
5.8. Перед приготовлением фекальной суспензии исходную пробу делят пополам. Одну часть пробы используют для приготовления фекальной суспензии, вторую - хранят при температуре не выше минус 20 °C на случай возникновения необходимости направления пробы в НЛДП или прове-
дения повторного исследования исходной пробы.
5.9. Перед исследованием на культуре клеток фекальные пробы обрабатывают хлороформом для удаления бактерий, грибков, цитотоксических липидов, разъединения вирусных агрегатов.
5.10. Для приготовления 10-20 % фекальной суспензии устойчивые к хлороформу полиэти-леновые центрифужные пробирки емкостью 50 мл маркируют номером пробы. В каждую пробирку вносят 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора (далее - ФСБ) с антибиотиками (приложение 2 к настоящим МУК), 1 г стеклянных бусин и 1 мл хлороформа. Затем в пробирку вносят 2 г фекаль-ной пробы. Плотно закрывают центрифужную пробирку и тщательно встряхивают в течение 20 ми-нут в механическом шейкере или вручную. Центрифугируют 20 минут при 1500 g в центрифуге с охлаждением. Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1).
Надосадочную жидкость каждой пробы переносят в два маркированных флакона с завин-чивающейся крышкой. Если жидкость непрозрачная, обработку хлороформом повторяют. Суспен-зию из одного флакона используют для исследования, второй флакон хранят при температуре не выше минус 20 °C для повторного исследования, если это будет необходимо.
5.11. Пробы, отобранные с помощью метода ректальной "соломинки", готовят для исследова-ния так же, как и фекальные пробы.
5.12. Если проба была отобрана с помощью ректального тампона, то емкость, содержащую тампон в транспортировочной среде или 0,9 % растворе NaCl, тщательно встряхивают в механиче-ском шейкере или вручную для того, чтобы фекальный материал перешел в жидкость. Стерильным пинцетом плотно прижимают тампон к стенке емкости и отжимают жидкость. Далее вносят 0,5 мл хлороформа и встряхивают, как описано в п. 5.10. Полученную жидкость переносят в центрифуж-ную пробирку и центрифугируют 20 минут при 1500 g в центрифуге с охлаждением. Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1).
Надосадочную жидкость переносят в два маркированных флакона: жидкость из одного флакона используют для исследования, второй - хранят при температуре не выше минус 20 °C.
5.13. Для исследования секционных материалов (кусочки тканей, помещенных в транспорти-ровочную среду), готовят 10 % суспензию в ФСБ с антибиотиками отдельно для каждой пробы. Ку-сочки тканей гомогенизируют в измельчителе (или растирают пестиком в охлажденной ступке с песком и 10 мл ФСБ). Переносят жидкость в центрифужную пробирку и центрифугируют 20 минут при 1500 g в центрифуге с охлаждением. Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1).
Надосадочную жидкость переносят в два маркированных флакона: жидкость из одного флакона используют для исследования, второй - хранят при температуре не выше минус 20 °C.
5.14. Участок толстой кишки вместе с содержимым используют для приготовления 20 % сус-пензии и обрабатывают так же, как пробы фекалий.
6.1. Для выделения полиовирусов из проб используют перевиваемые линии культур клеток RD и L20B. Использование комбинации этих двух клеточных линий обеспечивает высокую чув-ствительность и специфичность выявления полиовируса. Схема выделения вирусов на культурах клеток представлена в приложении 3 к настоящим МУК. Поддержание клеточных культур в лабора-тории выполняют в соответствии с методическими документами 30. При проведении вирусологиче-ских исследований применяются средства измерений, вспомогательное и испытательное оборудова-ние, расходные материалы и реактивы в соответствии с приложением 6 к настоящим МУК.
──────────────────────────────
29 ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.
30 ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.
──────────────────────────────
6.2. RD - клетки рабдомиосаркомы человека, чувствительные к полиовирусам, вирусам ECHO, некоторым вирусам Коксаки A (CVA), за исключением CVA1, CVA19, CVA22, энтерови-русам EV-A71, EV-D68. Вирусы Коксаки В могут проявлять цитопатический эффект (далее - ЦПЭ) на клетках RD.
6.3. L20B - линия мышиных клеток (L-клеток), способная экспрессировать рецептор полиовируса. Клетки L20B избирательно чувствительны к полиовирусам, которые вызывают в них
характерный ЦПЭ. Ряд вирусов, не относящихся к энтеровирусам (аденовирусы, реовирусы), могут вызывать ЦПЭ в клетках L20B, который отличается от ЦПЭ, свойственного полиовирусам.
6.4. Использование культуры клеток HEp-2 (Cincinnati), чувствительной к полиовирусам и вирусам Коксаки В, является факультативным.
6.5. НЛДП получает культуры клеток по запросу из лабораторий Глобальной лабораторной сети по полиомиелиту ВОЗ, РЦ ПОЛИО/ОВП - из НЛДП, учреждения, обеспечивающие деятель-ность территориальных органов, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор) - в РЦ ПОЛИО/ОВП, за которым они закреплены.
6.6. После получения клеточного материала РЦ ПОЛИО/ОВП создают банк клеток. Лабора-тории учреждений, обеспечивающих деятельность территориальных органов, осуществляющих фе-деральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор), закрепленные за РЦ ПОЛИО/ОВП, создают банк клеток при наличии возможностей. Запас каждой линии культуры клеток составляет не менее 12 ампул, которые используются по мере необходимости для создания рабочей линии клеток.
6.7. Для сохранения чистоты, аутентичности и стабильности клеточных культур следует заменять рабочую линию после 3-х месяцев или 15 пассажей культивирования в лаборатории.
6.8. Все действия с культурами клеток фиксируют в рабочих записях обозначая тип клеток, номер пассажа, дату получения, дату посева и все смены среды, наименования использованных реактивов, их серии и сроки годности.
6.9. Все работы с неинокулированными культурами клеток проводятся в отдельном боксиро-ванном помещении, расположенном в "заразной зоне" лаборатории, в БМБ 2 класса.
6.10. Для предотвращения перекрестной контаминации между различными типами клеточ-ных культур не допускается работа с несколькими культурами клеток одновременно.
6.11. Все неинокулированные культуры клеток следует считать потенциально опасными, поэтому после окончания работы все культуральные жидкости и культуры обеззараживают в соот-ветствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями 31, а также методическими докумен-тами 32.
6.12. Для контроля чувствительности культур клеток к полиовирусам проводят ежекварталь-ное титрование референс-штаммов полиовирусов (вакцинных штаммов Сэбина) (далее - референс-штаммы), имеющихся в коллекции в лаборатории, на каждой из культур клеток после 8-10 пассажей (приложение 4 к настоящим МУК).
6.12.1. Если титр референс-штаммов не отличается от заранее установленного значения ожи-даемого титра или отличается от него в пределах ± 0,5 lg, чувствительность клеток не изменилась.
6.12.2. Превышение ожидаемого значения на 0,5 lg или более может быть связано с погреш-ностями в приготовлении разведений вируса.
6.12.3. Снижение титра по сравнению с ожидаемым на 0,5 lg или более может указывать на снижение чувствительности клеток. В этом случае выполняют титрование новой порции референс-штамма. Одновременно проверяют возможные изменения в условиях культивирования клеток. Если низкий титр воспроизводится при титровании новой порции, а изменений в условиях культивирова-ния клеток не выявлено, используемые клетки необходимо заменить из клеточного банка лаборато-рии или получить по запросу в НЛДП или в РЦ ПОЛИО/ОВП.
6.13. Микроскопируют культуры с недавно сформированным монослоем клеток RD и L20B, выращенным на поверхности пластиковых флаконов площадью 25 см 2 или пробирок (нормальный монослой формируется в течение 2-3 дней после посева клеток). Ростовую среду, содержащую сыворотку, заменяют поддерживающей средой (8-10 мл на флакон, 1,0-1,5 мл на пробирку). Флако-ны или пробирки маркируют, указывая номер пробы, дату инокуляции, номер пассажа. Для иссле-дований одной пробы используют по одному флакону или по две пробирки каждой культуры на один пассаж. По одному флакону или пробирке с каждым типом клеток оставляют незараженными в качестве отрицательного контроля.
6.14. Флаконы или пробирки с клетками обеих линий инокулируют одновременно, внося за-ражающий материал из расчета 0,4-0,6 мл во флакон или 0,2 мл в пробирку. Культуры инкубируют при температуре плюс 36 °C, ежедневно микроскопируют, наблюдая за появлением ЦПЭ (приложе-ние 3 к настоящим МУК).
6.15. Результаты наблюдений за инокулированными и контрольными культурами регистриру-ют в рабочих записях, указывая дату заражения, даты учета результатов, результаты наблюдения за
развитием ЦПЭ фиксируют в рабочих записях. Развитие ЦПЭ, охватывающего 25 % монослоя, обо-значают 1+; 25-50 % обозначают 2+; 50-75 % обозначают 3+; 75-100 % обозначают 4+.
──────────────────────────────
31 Глава IV, таблицы 3, 7 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.
32 МУ-287-113.
──────────────────────────────
6.16. Быстрая дегенерация клеток в течение одного-двух дней после инокуляции может быть вызвана неспецифической токсичностью пробы. Культуры, проявившие признаки неспецифической дегенерации, замораживают при температуре не выше минус 20 °C, оттаивают и пассируют на клет-ках того же типа. Если признаки токсичности проявляются снова, возвращаются к исходной фекаль-ной суспензии, разводят ее 1:10 в ФСБ и повторяют процесс инокуляции (см. п. 6.14).
6.17. В случае бактериальной контаминации среды, возвращаются к исходному экстракту пробы, вновь обрабатывают его хлороформом, повторяют процедуры инокуляции (см. п. 6.14).
6.18. За появлением признаков ЦПЭ на зараженных клетках наблюдают не менее 5 дней.
6.18.1. При отсутствии ЦПЭ на любой из культур клеток проводят "слепой" пассаж в той же культуре клеток. Если результат отсутствия ЦПЭ повторяется, то результат считается негативным.
6.18.2. После появления характерного для энтеровирусов ЦПЭ (признаков разрушения культуры клеток, которые могут свидетельствовать о наличии НПЭВ), оцененного как 3+ и (или) 4+, прекращают инкубацию, культуру замораживают при температуре минус 20 °C. После этого пробу оттаивают и проводят перекрестный пассаж в другой линии клеток:
- из RD в L20B - для выяснения, не является ли полученный ЦПЭ полиовирусом;
- из L20B в RD - для накопления выделенного полиовируса в клетках RD. Время наблюдения появления ЦПЭ при перекрестном пассаже - до 5 дней.
6.18.3. В случае наличия ЦПЭ на культуре клеток L20B и его повторения в клетках RD результат учитывается как LR+.
6.18.4. В случае наличия ЦПЭ на культуре клеток RD и его повторения в клетках L20B, про-водят дополнительный пассаж в клетках RD для накопления вируса, результат учитывают как RLR+.
6.18.5. В случае наличия ЦПЭ на культуре клеток RD и его отсутствия в клетках L20B, про-водят пассаж исходного материала с клеток RD в клетках RD для накопления вируса, результат учи-тывают как НПЭВ.
6.18.6. Если ЦПЭ после перекрестного пассажа не повторяется, то результат учитывают как негативный.
6.18.7. Если ЦПЭ появился в зараженных клетках после "слепого" пассажа, производится пе-рекрестный пассаж по схеме, описанной в пункте 6.18.2.
6.19. Общий срок наблюдения за культурами с отрицательным результатом составляет не ме-нее 10 дней.
6.20. Изоляты полиовирусов и НПЭВ, выделенные в РЦ ПОЛИО/ОВП из материалов от больных полиомиелитом, ОВП и контактных с ними в очагах доставляют 33 в НЛДП, рекоменду-емый срок доставки материала - 72 часа от момента получения результата с предварительным уведомлением.
──────────────────────────────
33 Пункт 2450 СанПиН 3.3686-21.
──────────────────────────────
6.21. Изоляты полиовирусов, выделенные в РЦ ПОЛИО/ОВП из проб фекалий от детей из "групп риска", целесообразно доставлять 34 в НЛДП в течение 72 часов от момента получения результата с предварительным уведомлением.
6.22. Изоляты НПЭВ, выделенные в РЦ ПОЛИО/ОВП из проб фекалий от детей из "групп риска", направляются для идентификации в Референс-центр по мониторингу за энтеровирусными инфекциями, на базе ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (далее - референс-центр по мониторингу за энтеровирусными инфекциями), Дальневосточный региональ-ный научно-методический центр по изучению энтеровирусных инфекций, на базе ФБУН Хабаров-ский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора или Урало-Сибирский региональ-ный научно-методический центр по изучению энтеровирусных инфекций, на базе ФБУН ФНИИВИ "Виром" Роспотребнадзора 35 (далее - Дальневосточный или Урало-Сибирский региональные на-учно-методические центры по изучению энтеровирусных инфекций) по предварительному согласо-
ванию (сроки, количество, вид направляемого материала) 36.
6.23. При получении неопределенных или трудно интерпретируемых результатов, выделен-ный инфекционный агент направляется в НЛДП для идентификации 37, рекомендуемый срок достав-ки - 72 часа.
7.1. Идентификацию выделенных L20B+ изолятов (определение их принадлежности к полиовирусам или НПЭВ) и внутритиповую дифференциацию (далее - ВТД) полиовирусов про-водит НЛДП методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (далее - ОТ-ПЦР).
7.2. Для идентификации изолятов могут быть использованы тест-системы для проведения исследований методом ОТ-ПЦР, зарегистрированные и разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке 38.
──────────────────────────────
34 Пункт 2450 СанПиН 3.3686-21.
35 Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагно-стики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации" (далее - приказ Роспотреб-надзора от 01.12.2017 N 1116); приказ Роспотребнадзора от 19.12.2016 N 1236 "О совершенствовании эпидемиологиче-ского надзора за ЭВИ" (далее - приказ Роспотребнадзора от 19.12.2016 N 1236).
36 Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга и лабораторной диагно-стики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации"; пункт 5 приказа Роспотребнадзора от 19.12.2016 N 1236 "О совершенствовании эпидемиологического надзора за ЭВИ".
37 Пункт 2450 СанПиН 3.3686-21.
38 Часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Рос-сийской Федерации" (далее - Федеральный закон от 21.11.2011 N 323-ФЗ); постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий" (далее - постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416).
──────────────────────────────
7.3. ВТД проводится в течение 5 дней от момента получения материала из РЦ ПОЛИО/ОВП или получения ЦПЭ в НЛДП.
7.4. В случае получения результатов ВТД, указывающих на принадлежность полиовируса к ДПВ, ПВВП любых типов, вакциноподобному полиовирусу типа 2 (далее - ПВ типа 2), в том числе в виде смеси с вакциноподобными полиовирусами типов 1 и (или) 3, или НПЭВ, НЛДП в течение 7 дней от момента получения результатов проводит секвенирование участка генома белка VP1 изоля-та полиовируса.
8.1. Идентификация изолятов НПЭВ (установление типа) может быть выполнена с помощью молекулярно-генетического (секвенирование, ОТ-ПЦР) или серологического метода (в реакции ней-трализации на культуре клеток микрометодом).
8.2. Идентификацию НПЭВ с помощью молекулярно-генетических методов проводят в соот-ветствии с методическими документами 39.
8.3. Реакция нейтрализации выполняется в соответствии с методическими документами 40. Идентификацию изолята НПЭВ проводят на той культуре, на которой он выделен.
8.4. Для идентификации НПЭВ могут быть использованы тест-системы для проведения ис-следований методом ОТ-ПЦР, зарегистрированные и разрешенные к применению в Российской Фе-дерации в установленном порядке 41 в соответствии с методическими документами 42 и инструкци-ями производителей.
9.1. При получении положительного результата все материалы хранят в соответствии с сани-тарно-эпидемиологическими требованиями 43 до получения окончательного результата из лаборато-рии, проводящей идентификацию (для полиовирусов - из НЛДП, для НПЭВ - из референс-центра
по мониторингу за энтеровирусными инфекциями, Дальневосточного или Урало-Сибирского
──────────────────────────────
39 МР 4.2.0327-23 "Молекулярное типирование энтеровирусов", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 06.06.2023.
40 ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.
41 Часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416.
42 МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащем микроорганизмы I-IV групп патогенности", утвержденные руководителем Федераль-ной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным сани-тарным врачом Российской Федерации 22.12.2009.
43 Пункт 2556 СанПиН 3.3686-21.
──────────────────────────────
региональных научно-методических центров по изучению энтеровирусных инфекций) и по-сле получения окончательного результата обеззараживают в автоклаве и утилизируют в соответ-ствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями 44, а также методическими документами 45, за исключением специальных распоряжений по хранению.
9.2. Пробы фекалий, фекальные суспензии, кроме положительных на полиовирус типа 2 лю-бого происхождения, от больных полиомиелитом и ОВП, контактных лиц в очагах полиомиелита и ОВП, от здоровых детей из "групп риска" хранят при температуре не выше минус 20 °C 46. Рекомен-дуемый срок хранения - не менее 4 месяцев от момента поступления в лабораторию на исследова - ние. После истечения срока хранения материалы обеззараживают в автоклаве в соответствии с са-нитарно-эпидемиологическими требованиями 47, а также методическими документами 48.
9.3. При получении результата ВТД, указывающего на содержание в пробе ДПВ, ПВВП лю-бого типа, ПВ типа 2, все материалы (исходная проба, фекальная суспензия, изолят) по согласова-нию с НЛДП обеззараживаются и утилизируются в соответствии с санитарно-эпидемиологически-ми требованиями 49, а также методическими документами 50 или передаются в НЛДП. Целесообраз-но проводить обеззараживание, утилизацию или направление материалов в НЛДП в течение 72 ча-сов с момента получения результата ВТД.
10.1. Выявление специфических антител к полиовирусам типов 1, 2, 3 в сыворотках крови от больных полиомиелитом и ОВП проводят с диагностической целью в реакции нейтрализации инфекционности микрометодом (приложение 5 к настоящим МУК).
10.2. В основе определения титров антител с помощью реакции нейтрализации лежит принцип взаимодействия известного вируса с гомологичными антителами, присутствующими в сыворотке, что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на культуре клеток.
10.3. Для реакции нейтрализации с целью выявления антител к полиовирусу используют клетки HEp-2 (Cincinnati).
──────────────────────────────
44 Глава IV, таблица 7 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.
45 МУ-287-113.
46 Пункт 2553, 2556 СанПиН 3.3686-21.
47 Глава IV, таблица 7 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.
48 МУ-287-113.
49 Глава IV, таблица 7 приложения 2 СанПиН 3.3686-21; МУ-287-113.
50 МУ-287-113.
──────────────────────────────
10.4. Предварительно готовят рабочие запасы референс-штаммов (приложение 4 к настоя-щим МУК), используя для пассажа штаммы, полученные в НЛДП (выполняют не более 3-х после-довательных пассажей на культуре клеток HEp-2 при температуре плюс 36 °C). Рабочие запасы референс-штаммов разливают на аликвоты, достаточные для проведения одного опыта, в пластико-вые флаконы с завинчивающейся крышкой, маркируют и хранят при температуре от минус 20 °C до минус 70 °C. Перед проведением реакции нейтрализации определяют титр референс-штаммов, ис-ходя из которого рассчитывают рабочее разведение вируса каждого типа так, чтобы в 100 мкл ви-
руссодержащей жидкости содержалось 50 ТЦД 50 (допускаются колебания в интервале 50-200 ТЦД 50).
10.5. В каждый опыт включают контрольное титрование референс-сыворотки - сыворотки с известным уровнем нейтрализующей активности. Референс-сыворотка представляет собой смесь сывороток взрослых людей, недавно иммунизированных бустер-дозой полиомиелитной вакцины. Сыворотку разливают на аликвоты, которые хранят при температуре минус 20 °C.
11.1. Мероприятия по обеспечению биологической безопасности при проведении исследова-ний на полиовирусы организуются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требовани-ями 51 а также методическими документами 52.
11.2. К работе допускаются сотрудники, имеющие защитные титры вируснейтрализующих антител к полиовирусам. Иммунизация лиц, работающих с материалом, инфицированным или потенциально инфицированным ДПВ, ПВВП любого типа, ПВ типа 2, проводится в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями 53.
11.3. Все используемое лабораторное оборудование должно иметь инструкции по эксплуата-ции. Допустимо использование инструкций на бумажных и/или электронных носителях.
──────────────────────────────
51 Глава IV, приложения 2-3, пункты 2545-2571 СанПиН 3.3686-21.
52 МУ-287-113.
53 Пункты 2499, 2500 СанПиН 3.3686-21.
──────────────────────────────
11.4. Контейнеры из-под первичного материала, использованная одноразовая посуда, наконечники микропипеток, микротитровальные планшеты, пипетки и прочие расходные материа-лы во время проведения работ собирают в емкости, предназначенные для сбора отходов класса Б. После окончания работ - обеззараживают в автоклаве в соответствии с санитарно-эпидемиологиче - скимитребованиями 54, а также методическими документами 55. Стеклянную посуду обеззараживают дезинфицирующими средствами с вирулицидной активностью в отношении полиовирусов, за-регистрированными и разрешенными к применению в Российской Федерации в установленном по-рядке 56.
11.5. Обеззараживание рабочих поверхностей, оборудования проводят дезинфицирующими средствами с вирулицидной активностью в отношении полиовирусов, и последующей обработкой ультрафиолетом в соответствии с методическими документами 57.
11.6. Для снижения риска распространения ДПВ, ПВВП любого типа, ПВ типа 2 соблюдают следующие правила:
- использование ДПВ, ПВВП любого типа, ПВ типа 2 прекращается во всех случаях, где ту же задачу можно выполнить при помощи аттенуированных вакцинных штаммов полиовирусов типа 1 и 3, инактивированных антигенов или НПЭВ;
- во всех случаях, когда отсутствует необходимость хранения полиовирусов, все запасы ви-русов и потенциально инфицированных ими материалов, обеззараживают в автоклаве в соответ - ствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями 58, а также методическими документами 59.
11.7. При приготовлении и титровании референс-штаммов одновременно работают только с вирусом одного типа. Оптимальным является работа с вирусом каждого типа в отдельные дни.
──────────────────────────────
54 Глава IV, таблица 7 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.
55 МУ-287-113.
56 Раздел II Единого перечня продукции (товаров), подлежащей государственному санитарно-эпидемиологическому над-зору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза, утвержденного решением Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 N 299, с изменениями, внесенными решениями Комиссии Таможенного союза от 17.08.2010 N 341, от 20.09.2010 N 383, от 14.10.2010 N 432, от 18.11.2010 N 456, от 02.03.2011
N 566, от 18.10.2011 N 828, от 09.12.2011 N 859, решениями Совета Евразийской экономической комиссии от
15.06.20212 N 36, от 24.08.2012 N 73, от 17.12.2012 N 115, от 18.09.2014 N 78, от 02.12.2015 N 82, от 14.06.2018 N 64, от
22.02.2019 N 8, от 09.09.2019 N 97, от 04.09.2020 N 65, от 29.10.2021 N 109, от 18.02.2022 N 15, от 17.03.2022 N 28, от
25.01.2023 N 6, от 14.05.2024 N 51.
57 Р 3.5.1.4025-24 "Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в поме-щениях", утвержденное руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благопо - лучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 31.05.2024.
58 Глава IV, таблица 7 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.
59 МУ-287-113.
──────────────────────────────
Приложение 1
к МУК 4.2.4064-24
Перечень лабораторий, проводящих вирусологические исследования клинических материалов
от больных полиомиелитом и ОВП, с подозрением на эти заболевания, контактных с ними в очагах полиомиелита и ОВП, здоровых детей из "групп риска" 60
| Наименова-ние лаборато-рии | Организация, на базе которой функционирует лаборатория | Почтовый ад-рес | Телефон | Адрес электронной по-чты |
| Националь-ная лаборато-рия по диагностике полиомиелита | ФГАНУ "ФНЦИ-РИП им. М.П. Чума-кова РАН" (Институт полиомиелита) | 108819, г. Москва, по-селение Московский, пос. Институ-та полиомие-лита, двлд. 8, корп. 1 | +7 (495) 841 90 54 | lubov_i_k@mail.ru; ivanova_oe@chumakovs.s u; karpova_ev@chumakovs. su |
| лаборатория Московского РЦ ПОЛИО/ ОВП | ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве" | 129626, г. Москва, Графский пе-реулок, 4, корп. 2, 3, 4 | +7 (495) 687 36 16 | poliolab@mossanepid.ru |
| лаборатория Омского РЦ ПОЛИО/ОВП | ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Омской области" | 644116, г. Омск, 27-я Северная, 42а | +7 (3812) 68 08 37 | virus@mail.omsksanepid.r u |
| лаборатория Санкт-Петер-бургского РЦ ПОЛИО/ОВП | ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера | 197101, г. Санкт-Петербург, ул. Мира, 14 | +7 (812) 644 63 47 | kanaeva@pasteurorg.ru |
| лаборатория Свердлов-ского РЦ ПОЛИО/ОВП | ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области" | 620219, г. Екатерин-бург, Отдель-ный пер., 3 | +7 (343) 374 35 96 | snitkovskaya_te@66.rosp otrebnadsor.ru |
| лаборатория Став-ропольского РЦ ПОЛИО/ ОВП | ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Ставропольском крае" | 355008, г. Ставрополь, ул. Фадеева, 4 | +7 (865) 294 65 93 | poliost@fbuz26.ru |
| лаборатория Хабаровского РЦ ПОЛИО/ ОВП | ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Хабаровском крае" Роспотреб-надзора | 680009, г. Ха- баровск, ул. К.Маркса, 109б | +7 (421) 227 47 72 | khvvir@gmail.com |
──────────────────────────────
60 Пункты 2449, 2450, 2451, 2452 СанПиН 3.3686-21.
──────────────────────────────
Приложение 2
к МУК 4.2.4064-24
Приготовление сред и растворов
1. Фосфатно-солевой буферный раствор, pH 7,2 - 7,4
1.1. Допускается применение готовых сред, растворов, разрешенных к применению на тер-ритории Российской Федерации в установленном порядке 61.
1.2. Неполный раствор ФСБ, не содержащий ионы кальция или магния, можно использовать для отмывания клеток.
1.3. Приготовление раствора А (неполный раствор ФСБ):
Состав: NaCl 8,0 г, КСl 0,2 г, Na 2HPO 4 1,15 г, КН 2РО 4 0,2 г.
Ингредиенты растворяют в дистиллированной воде, добавляют 2 мл 0,4 % фенолового крас-ного - индикатора pH, доводят до 800 мл и автоклавируют при 0,7 атм в течение 15 минут.
1.4. Полный раствор ФСБ используется для приготовления экстрактов проб и для разведения вирусов, присутствие ионов Са и Mg стабилизирует вирусы (полиовирус и НПЭВ).
1.5. Приготовление раствора В:
MgCl 2●6H 2O 0,10 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Автоклавируют при 0,7 атм в течение 15 минут.
1.6. Приготовление раствора С:
CaCl 2 0,10 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Автоклавируют при 0,7 атм в те-чение 15 минут.
1.7. Рабочий раствор полного ФСБ:
К 8 частям раствора А добавляют 1 часть раствора В и 1 часть раствора С. Допускается ис-пользование таблетированной формы 0,01 М раствора ФСБ pH 7,40 ± 0,2.
2. Среда для транспортирования вирусов
2.1. Состоит из основного солевого раствора Хэнкса, доведенного до pH 7,4 буфером HEPES с 0,2 % бычьего сывороточного альбумина. В среду добавляют антибиотики - пенициллин (100 ЕД/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) (или гентамицин из расчета 30 - 50 мкг/мл) и феноловый красный в качестве индикатора. Среду разливают по 2,5 мл в надежно закрытые флаконы, хранят при температуре от 0 °C до плюс 8 °C в течение 4-6 недель.
2.2. Основной солевой раствор Хэнкса может быть заменен средой для культур клеток. В ис-ключительных случаях в качестве транспортировочной среды можно использовать стерильный 0,9 % раствор NaCl.
──────────────────────────────
61 Часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416.
──────────────────────────────
Приложение 3
к МУК 4.2.4064-24
Схема выделения вирусов на культурах клеток
Рис. 1. Схема выделения вирусов на культурах клеток
Приложение 4
к МУК 4.2.4064-24
Приготовление и титрирование референс-штаммов полиовирусов (вакцинных штаммов Сэбина)
1. Приготовление рабочих запасов референс-штаммов 62
1.1. Готовят флакон площадью 25 см 2 с культурой клеток HEp-2 (Cincinnati), сформиро-вавшей сливной здоровый монослой в течение 2-3 дней. Маркируют флакон, указывая вид культу-ры, дату инокуляции, лабораторный номер референс-штамма.
1.2. Сливают ростовую среду и ополаскивают клеточный слой ФСБ.
1.3. Вносят во флакон 0,2 мл вируссодержащей жидкости из пробирки с прототипным рефе-ренс-штаммом, полученным в НЛДП. Оставшееся количество прототипного референс-штамма хра-нят при температуре не выше минус 20 °C.
1.4. Инкубируют культуру при температуре плюс 36 °C в течение 1 часа, периодически осто-рожно покачивая флакон для лучшей адсорбции вируса.
1.5. Добавляют поддерживающую среду (около 10 мл), содержащую 5 % сыворотки плодов коровы. Флакон помещают в термостат при температуре плюс 36 °C.
1.6. Культуру просматривают ежедневно. После распространения ЦПЭ на 75-100 % клеточ-ного монослоя, флакон трижды замораживают и оттаивают для разрушения клеток.
1.7. Содержимое флакона переносят в центрифужную пробирку, центрифугируют при 1500 g 20 минут. Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1). Надосадочную жидкость по 0,5 мл переносят в пробирки, предназначенные для хранения референс-штамма, с этикетками, на которых указывают тип клеток, вирусный штамм, дата приготовления. Приготовленные лабораторные референс-штаммы хранят при температуре не выше минус 20 °C.
1.8. Определяют титр референс-штамма (см. п.п. 2.1-2.7).
1.9. Данные запасы вируса могут быть использованы для приготовления нужных объемов
для проведения исследований, для проведения процедуры контроля чувствительности клеточных культур. Вирус на культуре HEp-2 пассируют не более 3-х раз.
──────────────────────────────
62 ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.
──────────────────────────────
2. Определение титра референс-штаммов 63
2.1. Готовят разведение 10 -1 исследуемого вируса: 0,1 мл вируса вносят в пробирку, содержа-щую 0,9 мл среды.
2.2. Готовят ряд последовательных разведений от 10 -2 до 10 -8. В маркированные соответству-ющим образом пробирки разливают по 9,0 мл среды, в первую вносят 1,0 мл разведения 10 -1 ис-следуемого вируса. Новой пипеткой перемешивают содержимое пробирки, переносят 1,0 мл в следующую, меняют пипетку, вновь перемешивают и переносят 1,0 мл, и т.д.
2.3. Переносят по 100 мкл разведения вируса из пробирок в лунки рядов А-Н колонок 1-10 панели для микротитрования (рис. 2а). Для получения статистически достоверных результатов определения титра референс-штамма используют разведения 10 -5 - 10 -8, каждое разведение вносят в 20 лунок.
2.4. Вносят по 100 мкл поддерживающей среды в лунки колонок A11-Н рядов 11-12 для контроля клеток.
2.5. Готовят суспензию клеток в концентрации 1-2 х 105 клеток / 1,0 мл, вносят по 100 мкл во все лунки панели. Заклеивают панель пленкой и помещают в термостат при температуре плюс 36
°C.
2.6. Ежедневно микроскопируют панель, наблюдая за появлением ЦПЭ, окончательно учи-тывают результаты на 5-7 день. Тест считают действительным при образовании в лунках контроля сплошного монослоя нормальных клеток.
2.7. Расчет титра вируса проводят по формуле Кербера (2):
log ТЦД 50= L - d (S - 0,5)
(2)
где: L = log наименьшего разведения сыворотки в опыте;
d = разница между lg последовательных разведений;
S = сумма пропорций тест-объектов (лунок с культурой клеток), давших положительный результат (ЦПЭ) в каждом разведении.
В примере на рис. 2б титр вируса равен 10 6,6 ТЦД 50/0,1 мл, рассчитан по формуле (3):
log ТЦД 50 = -5 - 1 (2,1 - 0,5) = -6,6
(3)
──────────────────────────────
63 ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.
──────────────────────────────
Рис. 2. Определение титра референс-штамма
Приложение 5
к МУК 4.2.4064-24
Проведение реакции нейтрализации для выявления антител к полиовирусу
1.1. Готовят панели для микротитрования из расчета одна панель на каждый тип вируса, мар-кируют их, обозначая номер исследуемой сыворотки, тип вируса, дату постановки опыта.
1.2. Вносят 50 мкл питательной среды во все лунки панели, кроме лунок, предназначенных для контроля культуры клеток (ряды А-Н, колонки 11-12). В эти лунки вносят 100 мкл среды (рис. За).
1.3. Необходимый объем сыворотки, приготовленной для исследования, инактивируют в те-чение 30 минут при температуре плюс 56 °C.
1.4. Готовят разведение 1:4 каждой исследуемой сыворотки, а также референс-сыворотки в поддерживающей среде с добавлением 2 % сыворотки плодов коровы. Необходимо иметь как ми-нимум 600 мкл разведения 1:4 каждой сыворотки.
1.5. Вносят 50 мкл разведения 1:4 каждой сыворотки в соответствующие лунки колонок 1 и 2 в каждую из трех панелей (рис. За).
1.6. Используя микропипетку с одноразовым наконечником, аккуратно перемешивают со-держимое лунки 2 ряда А, отбирают 50 мкл, переносят в лунку 3, вновь перемешивают, отби-рают 50 мкл, переносят в лунку 4 и т.д., включая лунку 10. Из лунки 10, соответствующей разведе-нию 1:2048 после перемешивания 50 мкл содержимого отбрасывают (рис. 3б).
1.7. Повторяют вышеописанные процедуры для ряда В. Таким образом получены двукрат-ные разведения от 1:8 до 1:1024 сыворотки 1. Лунки колонки 1 рядов А и В служат для контроля
токсичности сыворотки, в них не добавляют вирус.
1.8. Аналогично вышеописанному готовят последовательные разведения второй исследу-емой сыворотки и референс-сыворотки. Таким образом, лунки рядов А-F колонок 1-10 предназначе-ны для исследования сывороток.
1.9. При титровании сывороток допускается использование многоканальных микропипеток, которые должны быть регулярно проверены, наконечники - соответствовать типу пипетки, для недопущения ошибок опыта.
1.10. Готовят суспензию нейтрализуемого полиовируса каждого типа с известным заранее титром в поддерживающей среде в количестве, достаточном для исследования намеченного числа сывороток. Разводят каждый вирус так, чтобы в 50 мкл вируссодержащей жидкости содержалось 100 ТЦД 50. Для одной панели необходимо примерно 4,0 мл вируса.
1.11. Пример определения рабочего титра вируса.
При предварительном титровании референс-штаммов на культуре клеток Hep-2 был установ-лен их титр (конечная точка титрования):
- полиовирус типа 1 - 9,02 lg/мл;
- полиовирус типа 2 - 8,44 lg/мл;
- полиовирус типа 3 - 8,66 lg/мл.
Разведение, которое дает концентрацию 100 ТЦД 50/мл - в 100 раз меньшее разведение, чем конечная точка титрования. Так как в лунку вносят 50 мкл разведения вируса, то его рабочее разве-дение должно быть в 20 раз меньше (или на 1,3 lg). Рабочее разведение референс-штаммов будет следующим:
- полиовирус типа 1 - 5,72 lg/мл (можно использовать разведение - 6);
- полиовирус типа 2 - 5,14 lg/мл (можно использовать разведение - 5);
- полиовирус типа 3 - 5,36 lg/мл (можно использовать разведение - 5).
1.12. Пример приготовления ряда последовательных разведений референс-штаммов (табл. 1).
Таблица 1
Пример приготовления ряда последовательных разведений референс-штаммов
| Разведения | Объем среды для разведения | Объем вирусной суспензии |
| 10 -1 | 0,9 мл | 0,1 мл |
| 10 -2 | 0,9 мл | 0,1 мл |
| 10 -3 | 0,9 мл | 0,1 мл |
| 10 -4 | 0,9 мл | 0,1 мл |
| 10 -5 - рабочее разведение для полиовирусов типов 2 и 3 | 3,6 мл | 0,4 мл |
| 10 -6 - рабочее разведение для полиовируса типа 1 | 3,6 мл | 0,4 мл |
| 10 -7 | 0,9 мл | 0,1 мл |
| 10 -8 | 0,9 мл | 0,1 мл |
1.13. Вносят 50 мкл рабочего разведения вируса определенного типа в лунки рядов А2-А10 - F2-F10 соответствующей типу вируса панели. В лунки колонок 1, 11, 12, а также рядов G и Н вирус не добавляют (рис. 3в). Ряды G и Н предназначены для титрования референс-вируса для контроля рабочей дозы. Вносят 50 мкл последовательных разведений вируса, начиная с наибольшего (от - 9 до - 5).
1.14. Панели заклеивают специальной пластиковой пленкой, закрывают крышкой, осторожно постукивают по краю панели для лучшего смешивания ингредиентов в лунках и помещают на 3 часа в термостат при температуре плюс 36 °C.
1.15. Готовят суспензию клеток HEp-2 в ростовой среде в концентрации 1-2 х 105 клеток в
1,0 мл.
1.16. Добавляют по 100 мкл клеточной суспензии во все лунки всех панелей. Заклеивают па-
нели, помещают в термостат при температуре плюс 36 °C на 5 дней. Учет результатов начинают на 3 день, окончательный учет - на 5 день.
1.17. При учете результатов обращают внимание на состояние контролей культуры, токсич-ность сыворотки, результаты контрольного титрования рабочих разведений референс-вирусов. Для контроля рабочей дозы каждого из использованных в опыте вирусов по формуле Кербера рассчиты-вают титр вируса (пункт 2.7 приложения 4 к настоящим МУК). Если рабочая доза выходит за преде-лы 50-200 ТЦД 50, результаты опыта считают недостоверными.
1.18. При учете результатов обращают внимание на воспроизводимость уже известных тит-ров референс-сыворотки. Если в опыте значения титров резко отличаются от ожидаемых, результа-ты опыта считают недействительными.
1.19. Рассчитывают конечную точку нейтрализации по формуле Кербера (пункт 2.7 приложе-ния 4 к настоящим МУК).
Переводят разведения сыворотки в логарифмические значения (разведение 1:4 = 2, 1:8 = 3, 1:16 = 4 и т.д.). Титром антител в сыворотке считается ее наибольшее разведение, защищающее 50 % тест-культур от действия 100 ТЦД 50 вируса. Титр вируса часто выражают величиной, обрат-ной разведению (например, при разведении 1:256 титр антител выражается как 256).
1.19.1. Пример расчета титра сыворотки (табл. 2, рис. 3г - сыворотка 1), формула (4):
lg ТЦД 50 = L - d (S - 0,5) = 11 - 1 (5,5 - 0,5) = 6 (1 : 64)
(4)
Таблица 2
Пример расчета титра сыворотки
| разведение сыворотки (lg) | пропорции тест-объектов | |
| 1:8 | 3 | 0/2 = 0 |
| 1:16 | 4 | 0/2 = 0 |
| 1:32 | 5 | 0/2 = 0 |
| 1:64 | 6 | 1/2 = 0,5 |
| 1:128 | 7 | 2/2 = 1 |
| 1:256 | 8 | 2/2 = 1 |
| 1:512 | 9 | 2/2 = 1 |
| 1:1024 | 10 | 2/2 = 1 |
| 1:2048 | 11 | 2/2 = 1 |
| S = 5,5 | ||
Рис. 3. Ход выполнения реакции нейтрализации для определения титра нейтрализующих ан-
тител к полиовирусу
Приложение 6
к МУК 4.2.4064-24
Средства измерений, вспомогательное и испытательное оборудование, расходные материалы и реактивы
1. При проведении лабораторной диагностики полиомиелита, обнаружении полиовирусов в пробах клинического материала применяют средства измерений, вспомогательное и испытательное оборудование, расходные материалы и реактивы, приведенные в таблицах П1.1 - П1.2.
Таблица П 1.1
Средства измерений, вспомогательное и испытательное оборудование
| Наименование средств измерений, вспомогатель-ного и испытательного оборудования | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| Автоклав большой (настольный для маленьких ла-бораторий) | - |
| Весы | - |
| Бокс микробиологической безопасности 2 класса | - |
| Центрифуга низкоскоростная с охлаждением | - |
| Компьютер с программным обеспечением | - |
| Счетная камера (для подсчета клеток) | - |
| Комплект автоматических дозаторов | одноканальные (диапазон 2-20 мкл, 20- 200 мкл, 100-1000 мкл) и восьмиканальные (диапазон 5-50 мкл, 30-300 мкл) |
| Морозильник | Температура минус 20 °C |
| Термостат стандартный | Рабочая температура 36 °C ± 1 °C |
| Термостат стандартный | Рабочая температура 37 °C ± 1 °C |
| Термостат с подачей СО 2 | Рабочая температура 36-37 °C |
| Контейнер для жидкого азота | 25 л |
| PH-метр с запасными электродами | - |
| Микроскоп инвертированный | - |
| Микроскоп обычный | - |
| Смеситель - вортекс | - |
| Сухожаровой стерилизатор | - |
| Холодильник | Температура плюс 4 °C |
| Штативы для пробирок | Диаметр 16 мм |
| Термометры стандартные | - |
| Термометры 0-100 °C | - |
| Дистиллятор воды | Для двойной или тройной перегонки |
| Деионизатор воды | - |
| Водяная баня | - |
| Примечание: допускается использование средств измерения, вспомогательного и ис-пытательного оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристи-ками. | |
Таблица П 1.2
Расходные материалы и реагенты для выделения полиовирусов
| Наименование лабораторной посуды и расходных материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| Халат (разные лабораторные зоны рекомендуется снабжать отдельным комплектом халатов) | - |
| Шапочки медицинские | - |
| Одноразовые перчатки | - |
| Бутылки | 60 мл, 125 мл, 250 мл, 500 мл, 1 л |
| Резиновые груши для работы пипетками | - |
| Флакончики для низких температур | 2 мл, 4 мл |
| Цилиндры градуированные | 100 мл, 500 мл |
| Пипетки серологические | 1 мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл, 25 мл |
| Бусы стеклянные | - |
| Хлороформ | - |
| Диметилсульфоксид | - |
| Флаконы для культур клеток | 75 см 2, 25 см 2 |
| Глутамин | - |
| Хэнкса раствор | - |
| Минимальная среда с буфером ХЕПЕС | - |
| Планшеты культуральные | 96 луночные |
| Клейкие пластины для запечатывания планшетов | - |
| ФСБ | - |
| Пенициллин и стрептомицин | - |
| Феноловый красный | - |
| Наконечники для микродозаторов одноразовые | 2-20 мкл, 10 мкл, 200 мкл |
| Микродозаторы одноканальные переменного объема | 2-20 мкл |
| Микродозаторы многоканальные переменного объема | 2-200 мкл |
| Сыворотка крови телячья плодная | - |
| Трипановый синий | - |
| Пробирки стерильные с крышками | - |
| Пробирки центрифужные (устойчивые к хло-роформу) | 15 мл |
| Версен | - |
| Трипсин | - |
| Лопаточки деревянные | - |
| Примечание: допускается использование расходных материалов и реагентов с аналогич-ными или лучшими характеристиками. | |
Нормативные и методические документы
1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополу-чии населения".
2. Федеральный закон от 21.11.2011 N 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Рос-сийской Федерации".
3. Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утвержде-нии Правил государственной регистрации медицинских изделий".
4. Единый перечень продукции (товаров), подлежащей государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза.
5. План действий по поддержанию свободного от полиомиелита статуса Российской Федера-ции на 2022 - 2024 гг.
6. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".
7. СанПиН 2.1.3684-21 "Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию террито-рий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабже-нию, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, обще-ственных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилакти-ческих) мероприятий".
8. Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы монито-ринга и лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации".
9. Приказ Роспотребнадзора от 19.12.2016 N 1236 "О совершенствовании эпидемиологиче-ского надзора за ЭВИ".
10. МУ 3.1.1.4016-24 "Эпидемиологический надзор за полиомиелитом и острыми вялыми па-раличами".
11. МР 4.2.0327-23 "Молекулярное типирование энтеровирусов".
12. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплифика-ции нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащем микроорганизмы I - IV групп пато-генности".
13. Р 3.5.1.4025-24 "Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обез-зараживания воздуха и поверхностей в помещениях".
14. МУ-287-113 "Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения".
Библиографические ссылки
1. А.Ю. Попова, Е.Б. Ежлова, А.А. Мельникова, Н.С. Морозова, Ю.М. Михайлова,
О.Е. Иванова, Л.И. Козловская, Т.П. Еремеева, А.П. Гмыль, Е.А. Короткова, О.Ю. Байкова, А.Ю. Красота, А.В. Иваненко, М.С. Ярмольская, И.В. Ковальчук, Е.Н. Романенко. Ответные меры по противодействию распространения вируса полиомиелита вакцинного происхождения типа 2 в России в 2016 г. Инфекция и иммунитет. 2020, Т. 10, N 1, с. 90-98.
2. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство / Г.Г. Онищенко, И.В. Брагина, Е.Б. Ежлова [и др.]; Под редакцией академика РАМН Г.Г. Онищенко, академика РАМН В.В. Кутырева. - издание 2-е, переработанное и дополненное. - Москва: ЗАО "Шико", 2013. - 560 с.
3. Olga Е. Ivanova, Tatiana Р. Eremeeva, Olga Y. Baykova, Alexandr Y. Krasota, Elizaveta V. Yakovchuk, Elena Y. Shustova, Lyudmila P. Malyshkina, Aida N.-I. Mustafina, Yulia M. Mikhailova, Alina V. Chirova, Evgeniya A. Cherepanova, Nadezhda S. Morozova, Anna S. Gladkikh, Anna S. Dolgova, Vladimir G. Dedkov, Areg A. Totolian and Liubov I. Kozlovskaya. Detection of Polioviruses Type 2 among Migrant Children Arriving to the Russian Federation from a Country with a Registered Poliomyelitis Outbreak. Vaccines 2024, 12, 718.
